▏ 名詞定義

Flp: Flp(flippase recombination enzyme)重組酶，是從酵母細胞內被發(fā)現的，其基因全長1272bp，為48kDa大小的、由423個氨基酸組成的多肽單體蛋白。

 

FRT: FRT(Flp Recombination Target)是Flp的識別位點，全長48bp，由3個13bp的反向回文序列和8bp的間隔序列共同組成。與間隔序列相鄰的兩個反向回文序列是Flp重組酶的識別和結合區(qū)域，間隔序列是重組發(fā)生的區(qū)域，也決定了整個序列的方向。
 

 

▏ Flp-FRT定點整合系統

      Flp-FRT整合系統是一種用于構建穩(wěn)定細胞系的方法，該細胞系可在宿主細胞基因組的特定位置表達目的基因。該系統利用 Flp 重組酶和 FRT（Flp 重組靶位）位點實現位點特異性重組和整合。該系統可實現目的基因的穩(wěn)定表達，確保細胞中蛋白質的持續(xù)生產。

▏ 工作原理

1. Flp-FRT細胞的構建：

將 Flp 重組靶位 (FRT) 位點引入宿主細胞系的基因組中，一般結構是ATG+FRT+抗性基因，根據母細胞選擇轉染方案，利用抗性篩選，可以得到穩(wěn)定細胞株。

科佰思考1：一般認為這一步的構建，FRT會整合到細胞的轉錄活躍區(qū)位置，也就是說為了后續(xù)的重組外源目的基因的表達，這一步的整合給了外源蛋白過表達提供了一定的保障。

       具體的整合位置可以咨詢我們的ISS（integration site search）服務。
 

科佰思考2：作為常規(guī)的質粒轉染方案，宿主細胞能整合幾個拷貝進去？選擇幾個拷貝為好？一般而言構建Flp-FRT母細胞時，轉染后是隨機整合，也就是會存在多個拷貝整合到宿主細胞的不同染色體位置。整合的越多，未來目的基因重組整合的也多，也就是表達會更高，但是反過來未來重組目的基因時，多個拷貝的整合效率可能不是100%的，也就是會出現混合克?。寺￠g表達高低不一致），有時針對不需要表達很高的目的蛋白，科佰建議選擇1個拷貝的整合克隆，這樣未來只要經過抗性篩選的克隆，從原理上說就是單克隆，省去了有限稀釋做單克隆的過程。
 

拷貝數檢測，可以咨詢我們的dPCR檢測服務。

 

科佰生物內部現貨Flp-FRT細胞

 

Cell line	Host cell line	Characteristic
Flp-FRT CHO	CHO-K1	Adherent
Flp-FRT HEK293	HEK293	Adherent
Flp-FRT HCT116	HCT116	Adherent
Flp-FRT Jurkat	Jurkat	Suspension

 

2. 目的基因的整合：

 

將含有目的基因的表達載體、含有Flp重組酶的表達載體共轉入第一步中的細胞。在Flp 重組酶的介導下，宿主基因組中的 FRT 位點與表達載體中的 FRT 位點之間的位點特異性重組，達到目的基因整合的目的，在啟動子的作用下，穩(wěn)定表達。

 

載體一:

過表達Flp重組酶，無需抗性，無需穩(wěn)定整合

 

載體二:

含有目的基因，第二種抗性基因篩選標記

 

重組過程：

 

最終形成：

重組后，可以通過第二種抗性基因來選擇得到陽性細胞，改細胞對抗性基因-2耐受，對抗性基因-1敏感

 

 

▏ Flp-FRT系統的優(yōu)勢

1

定點整合，不會隨機整合穿插到染色體的任意位置；

2

可控拷貝數，可以通過Flp-FRT細胞的拷貝數來控制目的基因的拷貝數；

3

穩(wěn)定表達，相對于隨機整合，該表達系統更穩(wěn)定，同時可以同抗性基因2篩選，用抗性基因1驗證；

4

表達量高，重組酶整合效率高，且整合在轉錄活躍區(qū)；

5

實驗周期短，選擇單拷貝的基因組，可以省去有限稀釋制備單克隆的過程。

 

▏ 穩(wěn)定細胞株構建服務

科佰生物提供“Flp-FRT定點整合系統”穩(wěn)定細胞株構建服務，利用該系統，我們已經成功構建超過200株穩(wěn)定細胞株的模型，有著豐富的經驗，歡迎溝通咨詢。
 

		質粒轉染		病毒感染	Flp-FRT系統	轉座子系統	基因編輯
		脂質體	電轉	慢病毒
適用細胞		部分細胞	幾乎所有細胞	幾乎所有細胞	內部4種細胞	幾乎所有細胞	部分細胞
轉染/感染效率		低	中	高	高	高	低
隨機整合		是	是	是	否	-	否
生物安全登記		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因裝載能力		-	-	<4-5k	-	-	-
陽性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包裝	-	-	1周	-
	混合克隆篩選	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	單克隆篩選	>3 周	>3 周	>3 周	可選	可選	>3 周
	合計	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作負荷		高	中	中	低	低	高